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Bioproduire grâce aux bactéries – Comment moduler l’expression des gènes chez les Clostridia ?


Le chercheur Andrew Tolonen et son équipe nouvellement créée grâce au programme Atige* de Genopole, ont développé un ensemble d’outils biotechnologiques pour la transformation génétique et le contrôle de l’expression des gènes chez les bactéries du genre Clostridium.
Equipe ATIGE d'Andrew Tolonen au sein de l'unité de Génomique métabolique du Genoscope - Tutelles CEA / CNRS / Université d'Evry - Paris-Saclay Equipe ATIGE d'Andrew Tolonen au sein de l'unité de Génomique métabolique du Genoscope - Tutelles CEA / CNRS / Université d'Evry - Paris-Saclay

Ces travaux ouvrent la voie à des applications de production par voie biologique. Les Clostridia, capables de fermenter la biomasse végétale, notamment les fibres lignocellulosiques présentes dans les débris végétaux, pourraient ainsi produire des molécules à haute valeur ajoutée comme des médicaments ou autres composés d’intérêt.

Clostridium phytofermentansL’équipe d’Andrew Tolonen, composée de Tom Zaplana (doctorant), Ali Khazem (Master 2, mSSB Univ Evry Paris-Saclay), Magali Boutard (technicienne supérieure), Paul Weimer (Master 2, mSSB Univ Evry Paris-Saclay), Solange Miele (chercheure),  installée dans l’Unité de Génomique métabolique (CEA/CNRS/Université d’Evry Paris-Saclay) du laboratoire Genoscope, a développé une approche méthodique pour optimiser l’ingénierie génétique de Clostridium phytofermentans, utilisée ici comme espèce modèle pour une application plus large au genre Clostridium. Le groupe de scientifiques a tout d’abord optimisé la transformation génétique de la bactérie, puis recherché les moyens de moduler l’expression des gènes d’intérêt apportés.

Clostridium phytofermentans est capable d’utiliser comme substrat la lignocellulose contenue dans les fibres végétales et de la transformer en différents composés. Les travaux des chercheurs génopolitains ont apporté à cette bactérie les outils biotechnologiques et les méthodes qui faisaient défaut pour valoriser cette propriété pour des applications de bioproduction.

La boîte à outils créée par l’équipe évryenne comprend :

  • Une méthode simple d’électroporation permettant l’entrée à travers la paroi bactérienne de l’ADN portant le gène d’intérêt, sous l’effet d’un courant électrique.
  • Des plasmides, éléments d’ADN circulaire dans lesquels le fragment d’ADN peut être inséré, jouant ainsi le rôle de vecteurs, sélectionnés pour optimiser la transformation de Clostridium phytofermentans.
  • Des gènes de résistance à des antibiotiques, dits « marqueurs », fonctionnels chez les Clostridia pour sélectionner les bactéries correctement transformées en les cultivant sur des milieux complémentés de ces antibiotiques.
  • Un ensemble de promoteurs dont l’insertion en amont du gène d’intérêt active de 4 à 2000 fois son expression.
  • Un promoteur modulant l’expression du gène sous l’action double d’un répresseur chimique et d’un inhibiteur de répression, en ajustant leurs concentrations respectives.
  • Un système dit « d’interférence » reposant sur le complexe Crispr-dCas12, réunissant ces éléments régulateurs pour pouvoir expérimentalement contrôler de manière coordonnée l’expression des gènes apportés à la bactérie et des gènes assurant son métabolisme ; le complexe Crispr-Cas connu pour couper l’ADN en un site bien précis utilise ici la même technique de guidage pour réprimer spécifiquement l’expression d’un gène.

Le set complet de méthodes et outils d’ingénierie génétique développé par l’équipe évryenne ouvrent des perspectives de régulation fine de l’expression des gènes chez les Clostridia. Ces bactéries sont prometteuses pour transformer les ressources de carbone renouvelables, notamment la biomasse végétale, en molécules d’intérêt. Il serait ainsi envisageable de moduler différentiellement l’expression des gènes naturels de la bactérie pour surexprimer un gène particulier, produisant une protéine utile pour l’industrie, ou d’insérer un gène d’intérêt et réprimer les gènes métaboliques naturels de la bactérie au profit de ce gène.

Développer de bioprocédés d'intérêt industriel


Ces travaux ont fait l’objet d’une publication dans ACS Synthetic Biology le 25 novembre 2022. Ils constituent une base pour le développement de bioprocédés de production de molécules d’intérêt industriel, un axe majeur de la filière stratégique de la bioéconomie à Genopole.

Références

Tuning of Gene Expression in Clostridium phytofermentans Using Synthetic Promoters and CRISPRi

ACS Synthetic Biology, 2022.

https://doi.org/10.1021/acssynbio.2c00385

Schéma de synthèse : Une boîte à outils biotechnologiques adaptée aux bactéries Clostridia. Une boîte à outils biotechnologiques adaptée aux bactéries Clostridia. UMR Metabolic Genomics - Genoscope

  • Elle fournit une méthode d’électroporation, des plasmides (boucle grise d’ADN circulaire sur le schéma) à intégrer dans la bactérie via cette méthode et les marqueurs de sélection nécessaires au tri des bactéries effectivement transformées.
  • Elle propose aussi un ensemble d’outils génétiques que l’on peut insérer dans le plasmide pour moduler l’expression du gène d’intérêt ou « gène cible » (« target » sur le schéma). La figure ci-dessus en présente un exemple : la transcription d’un ADN « guide » inséré dans le plasmide produit un ARN guide capable de s’accrocher à la protéine produite par un 2e gène apporté, dCas12a. Le complexe ainsi formé se fixe spécifiquement sur le promoteur du gène cible et en réprime l’expression.
  • L’expression du dCas12a est contrôlable par le répresseur tetR, intégré lui aussi à la construction génétique. Ce dernier se fixe sur le promoteur de dCAS12a. L’ensemble est modulable expérimentalement par l’apport dans le milieu de culture de la molécule aTc en plus ou moins grande quantité.

Ce schéma peut être reproduit avec différents guides pour s’étendre à plusieurs gènes cibles, les gènes propres à la bactérie ou les gènes d’intérêt apportés.

🎙 Lire l’article et écouter le podcast d’Andrew Tolonen

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